Testy immunologiczne

TESTY IMMUNOLOGICZNE | DIAGNOSTYKA | PODSTAWY | ANTYGEN-PRZECIWCIAŁO

Test immunologiczny to metoda biochemiczna, która identyfikuje i określa ilościowo, jakościowo lub pół ilościowo nieznane anality jak np. białka, lipidy, kwasy nukleinowe, w roztworach (m.in. surowicy, moczu, ślinie) wykorzystując reakcję przeciwciało-antygen. Istnieje wiele różnych formatów i odmian testów immunologicznych, ale kluczową kwestią jest nadal specyficzne rozpoznawanie przeciwciał-antygenów. Co to jest antygen i przeciwciało? Dlaczego przeciwciało może wiązać się z antygenem? Antygen to cząsteczka rozpoznawana przez układ odpornościowy, zwłaszcza przez przeciwciała. Białka, polisacharydy, pestycydy, antybiotyki, toksyny i hormony mogą być antygenami, jednak nie wszystkie antygeny mogą stymulować układ odpornościowy do wytwarzania przeciwciał. Antygen, który może wywołać odpowiedź immunologiczną, a zwłaszcza syntezę przeciwciał, nazywany jest immunogenem. Białka o masie cząsteczkowej powyżej 5-10 kDa są immunogenami, podczas gdy małe peptydy, pestycydy, antybiotyki czy hormony nie. Te substancje o niskiej masie cząsteczkowej nazywane są haptenami i muszą być chemicznie sprzężone z większymi cząsteczkami nośnika, takimi jak albumina surowicy bydlęcej (BSA) lub hemocyjanina skałoczepa (KLH), aby wywołać specyficzne wytworzenie przeciwciał. Przeciwciało jest dużym białkiem w kształcie litery Y (160 kDa) posiadającym dwa miejsca wiązania (paratopy), które specyficznie wiążą się z ograniczoną powierzchnią (epitopem) antygenu. Epitopy są przeważnie zlokalizowane na hydrofilowej części antygenu, a ich wielkość to 10-15 reszt aminokwasowych, które mogą być ciągłe w łańcuchu białkowym (epitop liniowy) lub nieciągłe, ale przestrzennie blisko niego. Reakcja przeciwciało-antygen jest typową odwracalną reakcją dwu cząsteczkową o stałej szybkości reakcji do przodu i do tyłu, które są zależne od stężenia antygenu (Ag) i przeciwciała (Ab), powinowactwa do antygenu zdefiniowanego przez stałą asocjacji przeciwciała dla jego antygenu, temperatury, pH i innych warunków środowiskowych. Testy immunologiczne opierają się na wiązaniu i kompleksie antygenu z przeciwciałem, a ludzie używają pewnych fizycznych lub chemicznych środków do pomiaru i ilościowego określenia kompleksu antygen-przeciwciało.

IMMUNOPRECYPITACJA | WYODRĘBNIANIE | Ag-Ab

Opracowano szereg metod wizualizacji pierwotnej reakcji Ag-Ab. Wytrącanie dużych usieciowanych kompleksów Ag-Ab może być widoczne gołym okiem bez użycia znakowanych odczynników do amplifikacji. Reakcja precypitacji to wysoce specyficzna reakcja serologiczna polegająca na wiązaniu antygenu przez przeciwciało. Każde przeciwciało ma dwa miejsca wiązania antygenu, a każdy antygen ma wiele epitopów antygenowych. Gdy rozpuszczalne antygeny są wiązane przez przeciwciało, tworząc usieciowaną strukturę „sieciową”, reakcję nazywa się wytrącaniem. Reakcja wytrącania jest hamowana, gdy antygen lub przeciwciało występuje w dużym nadmiarze. Zakres optymalnych stężeń, przy którym generowana jest największa ilość opadów, nazywany jest strefą równoważną. Opierając się na tej zasadzie, obecność specyficznych antygenów w mieszaninie i względne stężenie antygenów można wykryć przy użyciu przeciwciał. Do określenia względnych stężeń przeciwciał lub antygenów można zastosować dwa typy reakcji precypitacji. Są to radialna immunodyfuzja (metoda Manciniego) i podwójna immunodyfuzja (metoda Ouchterlony). Obie są przeprowadzane na półstałym podłożu, takim jak agar. W radialnej immunodyfuzji próbkę antygenu umieszcza się w dołku i umożliwia dyfuzję do agaru zawierającego odpowiednie rozcieńczenie surowicy odpornościowej. Gdy antygen dyfunduje do agaru, ustala się obszar równoważności i wokół dołka tworzy się pierścień precypitacji oraz pierścień precypitynowy (Rysunek 2b). Powierzchnia pierścienia precypitynowego jest proporcjonalna do stężenia antygenu. Porównując powierzchnię pierścienia precypitynowego z krzywą standardową (uzyskaną przez pomiar obszarów precypitynowych o znanych stężeniach antygenu), można określić stężenie próbki antygenu. W metodzie Ouchterlony zarówno antygen, jak i przeciwciało dyfundują promieniście ze studzienek do siebie, tworząc w ten sposób gradient stężeń. Po osiągnięciu równoważności tworzy się widoczna linia opadów (ryc. 2c).

Chociaż są użyteczne, immunodyfuzja i immunoelektroforeza są żmudne i czasochłonne, trudne do zautomatyzowania i niełatwe do zastosowania w analizie próbek masowych.

ZNAKOWANIE | RODZAJE TESTÓW| DIAGNOSTYKA

Testy immunologiczne wykorzystują wiele różnych znaczników, aby umożliwić wykrywanie przeciwciał i antygenów. Etykiety są zwykle połączone chemicznie lub skoniugowane z pożądanym przeciwciałem lub antygenem. Zgodnie z różnicą strategii wykrywania znacznika i sygnału, test immunologiczny można podzielić na następujące typy:

Test radioimmunologiczny (RIA)
RIA to test immunologiczny wykorzystujący izotopy radioaktywne (np. I-235) do znakowania przeciwciała / antygenu. Wykrywa radioaktywność, aby zmierzyć związek przeciwciało-antygen z bardzo wysoką czułością. RIA były jednymi z najwcześniej opracowanych testów immunologicznych, które wypadły z łask w dużej mierze z powodu trudności i potencjalnych niebezpieczeństw, jakie stwarza praca z radioaktywnością.
Test immunoenzymatyczny (EIA)
EIA jest prawdopodobnie jednym z najpopularniejszych stosowanych testów immunologicznych. Zamiast radioaktywnych izotopów, EIA wykorzystuje enzymy (np. HRP, AP) jako sondy. Enzymy te często pozwalają na wykrywanie, ponieważ powodują zauważalną zmianę barwy w obecności pewnych odczynników substratu i chromogenu (np. DAB, TMB) w oparciu o reakcje enzymatyczne.
Test fluoroimmunologiczny (FIA)
FIA jest analogiczna do RIA, z tym wyjątkiem, że znacznik jest raczej fluoroforem (np. FITC, fikoerytryna) niż radioizotopem. Sygnał fluorescencji można zmierzyć bezpośrednio za pomocą przyrządu wykrywającego.
Immunotest chemiluminescencyjny (CLIA)
CLIA to metoda określania stężenia próbek na podstawie intensywności luminescencji emitowanej w wyniku reakcji chemicznej. CLIA łączy systemy CL i immunoreakcje. Niektóre odczynniki zostały użyte jako znaczniki CL. Po wprowadzeniu substratów CL system wytwarza chemiluminescencję. Dzięki temu próbki można wykryć ilościowo. Najpopularniejszymi substratami CL są luminol, izoluminol i ich pochodne, pochodna estru akrydyniowego, peroksydaza i fosfataza alkaliczna (ALP).
Test immunochromatograficzny (ICA)
ICA, znany również jako test immunologiczny przepływu bocznego, jest szybkim testem immunologicznym służącym do wykrywania obecności (lub braku) docelowego analitu w próbce (matrycy) bez konieczności stosowania specjalistycznego i kosztownego sprzętu. W tego rodzaju oznaczeniu przeciwciała wychwytujące są unieruchamiane w postaci linii krzyżowej na porowatych materiałach hydrofilowych. Anality w buforze są następnie dodawane po jednej stronie paska testowego, napędzane boczną siłą kapilarną. Anality przepływają przez linię wychwytujących przeciwciał i są wychwytywane przez przeciwciało. W miarę gromadzenia się wychwyconych analitów kompleks mógł zostać ujawniony przez znaczniki nanocząstek (zwykle złoto koloidalne) i oglądany bezpośrednio gołym okiem.
Immunohistochemia (IHC)
IHC łączy techniki histologiczne, immunologiczne i biochemiczne do identyfikacji określonych składników tkanki za pomocą specyficznej reakcji antygen / przeciwciało, oznaczonej widocznym znacznikiem. IHC umożliwia wizualizację dystrybucji i lokalizacji określonych składników komórkowych w komórce lub tkance. Najpopularniejszym typem IHC jest wykrywanie chromogenne i fluorescencyjne, w których pośredniczy odpowiednio enzym lub fluorofor, których podstawowa zasada jest równa EIA i FIA.

_

PORÓWNANIE | WADY | ZALETY

Porównanie pięciu różnych wyznakowanych testów immunologicznych powyżej przedstawiono w poniższej tabeli. Każda metoda ma swoje zalety i wady, więc mogliśmy elastycznie wybrać najbardziej odpowiednie środki do optymalizacji naszego testu.

Test Ilustracja Znakowanie Podłoża Sygnał Czułość Zalety Wady
Test radioimmunologiczny
(RIA)
Radioimmunoassay Izotopy radioaktywne (I-125) Promieniowanie Ultra wysoka 1. Czuły i precyzyjny
2. Koniugacja znacznika radioaktywnego łatwa do przygotowania
1. Radioizotopy muszą być wykorzystane w ciągu kilku tygodni
2. Ryzyko narażenia na promieniowanie
Test immunoenzymatyczny (EIA) Enzyme Immunoassay Enzymy (HRP, AP) Chromogen / substrat Zmiana barwy Wysoka 1. Czuły i bezpieczny
2. Szybki i wygodny, łatwy do automatyzacji
3. Szeroko stosowany w różnych testach
1. Potrzebujesz przeciwciała monoklonalnego
2. Absorpcja niespecyficzna
3. Reakcja enzym / substrat jest krótkotrwała
Test fluoroimmunologiczny (FIA) Fluorenscence Immunoassay Barwniki fluorescencyjne (rodamina) Fluorescencja Wysoka 1. Czuły, specyficzny i bezpieczny
2. Ograniczona fluorescencja tła
3. Łatwość automatyzacji
4. można używać wielu znaczników
1. Polega na przyrządzie do wykrywania fluorescencji
2. Fotowybielanie
Immunotest chemiluminescencyjny (CLIA) Chemiluminescence Immunoassay Sondy chemiczne
(Ester akrydyniowy, luminol)
podłoże luminescencyjne Widzialne światło Ultra wysoka 1. Doskonała czułość i bezpieczeństwo
2. Stabilny odczynnik
3. Łatwość automatyzacji, możliwość zastosowania w systemie o dużej przepustowości
Potrzebujesz sprzętu CCD do przechwytywania sygnału świetlnego
Test immunochromatograficzny (ICA) Colloidal Gold Immunochromatorgraphic Assay Koloidalna nanocząstka złota Widoczny kolor Średnia 1. Szybki, łatwy, bezpieczny w użyciu
2. Niski koszt
3. Możliwy odczyt wizualny
Relatywnie niższa czułość oraz specyficzność w porównaniu do innych technik

_

You've just added this product to the cart: